Redacción técnica de GLP México · Actualizado el · Política editorial
Qué representa la figura
Un cromatograma es el registro de la señal de un detector a lo largo del tiempo. En la cromatografía líquida en fase reversa que se usa para péptidos, la muestra se inyecta en una columna apolar y un gradiente va aumentando la proporción de disolvente orgánico; cada componente sale de la columna en un momento distinto según su hidrofobicidad, y al pasar por el detector ultravioleta produce un pico. El principio de la separación y lo que significa el porcentaje resultante están en HPLC 99 %: qué mide realmente y qué no; aquí interesa el dibujo.
El esquema que acompaña a esta sección es ilustrativo: no corresponde a ningún lote ni a ningún compuesto, y sirve solo para nombrar las partes.
Los ejes
El eje horizontal es el tiempo, en minutos, desde la inyección. El eje vertical es la respuesta del detector: absorbancia, normalmente en miliunidades de absorbancia (mAU), a la longitud de onda que indique el método. En péptidos lo habitual es medir entre 210 y 220 nm, la zona donde absorbe el enlace peptídico, de modo que cualquier cadena de aminoácidos da señal.
Una figura sin magnitudes en los ejes, sin longitud de onda declarada o con una escala ilegible no se puede evaluar. No es un detalle de presentación: la longitud de onda decide qué especies se ven y cuánto pesan en el resultado, y un mismo lote puede dar porcentajes distintos a 214 y a 280 nm.
La línea base y el frente del disolvente
La línea base es la señal del detector cuando no sale nada de la columna. En un método en gradiente rara vez es horizontal: a longitudes de onda bajas el propio disolvente orgánico y el ácido modificador absorben algo, y conforme cambia la composición de la fase móvil la línea base deriva suavemente hacia arriba o hacia abajo. Una deriva suave es normal; una línea base ruidosa o con ondulaciones grandes dificulta la integración de los picos pequeños.
Al principio del cromatograma aparece casi siempre una perturbación, positiva o negativa: es el frente del disolvente, el momento en que sale lo que no se retiene en la columna —el disolvente de la muestra, sales, el contraión—. No es una impureza del péptido y los métodos suelen excluirlo de la integración. Conviene saberlo para no contarlo como un pico, y para recordar que todo lo que sale ahí, o que no absorbe, no entra en el porcentaje de pureza.
El tiempo de retención
El tiempo de retención es el minuto en que aparece el máximo de un pico. Depende de la molécula, pero también de la columna, del gradiente, del caudal y de la temperatura, así que solo es comparable entre cromatogramas obtenidos con el mismo método. Que dos certificados de proveedores distintos den tiempos distintos para el mismo péptido no significa nada; que dos lotes del mismo proveedor, con el mismo método declarado, den tiempos muy distintos sí merece una pregunta.
El tiempo de retención no identifica a la molécula. Un pico a los 12.4 minutos dice que algo salió a los 12.4 minutos en esas condiciones; qué es ese algo lo establece la espectrometría de masas, no el cromatograma.
El pico principal: forma, hombros y colas
En un material de pureza alta domina un solo pico. Su forma informa tanto como su tamaño. Un pico simétrico y estrecho es lo esperable. Una cola alargada hacia la derecha es frecuente en péptidos básicos y por sí sola no indica impureza. Un hombro —una inflexión en la subida o en la bajada— o un pico claramente partido sí sugieren que hay dos especies que el método no termina de separar: una secuencia con un residuo de menos, una forma oxidada o desamidada, un diastereómero.
Ese es el límite más importante de la figura: lo que coeluye bajo el pico principal se cuenta como producto. Un pico limpio es compatible con un material homogéneo, pero no lo demuestra.
Los picos menores y la escala
Las impurezas relacionadas con la síntesis aparecen como picos pequeños antes o después del principal. En un cromatograma dibujado a escala completa, con el pico principal ocupando toda la altura, una impureza del 0.5 % es una irregularidad apenas visible sobre la línea base. Por eso los informes cuidadosos incluyen una vista ampliada del eje vertical, en la que el pico principal se sale del gráfico y la línea base se ve con detalle.
Una figura en la que la línea base parece perfectamente lisa no prueba que no haya impurezas: puede probar solo que la escala no permite verlas. Lo que resuelve la duda es la tabla de picos.
La tabla de picos y la integración
Junto a la figura, el informe del equipo lista cada pico integrado con su tiempo de retención, su área, a veces su altura y su porcentaje de área. El porcentaje de pureza es el área del pico principal dividida entre la suma de las áreas de todos los picos integrados. Las comprobaciones son elementales: que el número de picos de la tabla corresponda a lo que se ve en la figura, que los porcentajes sumen cien y que el tiempo de retención del pico principal de la tabla sea el del pico dominante del gráfico.
Integrar es decidir dónde empieza y dónde termina cada pico y por dónde pasa la línea base debajo de él. Esas decisiones las toma el software con parámetros que fija el analista: un umbral de área o de altura por debajo del cual un pico no se cuenta, y un criterio para separar picos solapados. Dos integraciones razonables del mismo cromatograma pueden diferir en décimas de punto. Por eso un 99.1 % y un 99.4 % no son resultados distintos en ningún sentido práctico, y por eso un umbral de integración demasiado alto es la forma más sencilla de mejorar un porcentaje sin mejorar el material.
Lo que debe acompañar a la figura
Un cromatograma evaluable viene con su cabecera: identificación de la muestra y número de lote, fecha y hora de la inyección, columna (fase y dimensiones), fases móviles, programa de gradiente, caudal, longitud de onda de detección y volumen inyectado. Con esos datos un tercero podría, en principio, repetir la medida; sin ellos la figura es una ilustración.
Las señales de un documento reciclado se detectan precisamente aquí: la misma imagen, píxel por píxel, en certificados de lotes distintos; una fecha de inyección anterior a la de fabricación; un tiempo de retención en la tabla que no coincide con el del gráfico. Están reunidas en cómo detectar un COA falsificado.
Lo que la figura no demuestra
Incluso un cromatograma impecable responde una sola pregunta: de todo lo que el detector vio en esas condiciones, qué fracción de la señal corresponde a la especie mayoritaria. No dice qué molécula es esa especie, no dice cuántos miligramos de péptido hay en el vial —el agua residual y el contraión no absorben y no aparecen— y no ve lo que coeluye. Es la misma lista de límites que recoge nuestra metodología analítica, y la razón por la que el porcentaje de HPLC se lee siempre junto con la confirmación de masa y, cuando existe, con el contenido peptídico neto.
Leído así, el cromatograma deja de ser un adorno del certificado y pasa a ser lo que es: la evidencia primaria de la que sale el número. El resto del documento se recorre campo por campo en cómo leer un certificado de análisis.