Control analítico · método

Metodología analítica: cómo se analiza y documenta cada lote

Un certificado de análisis (COA) reúne mediciones hechas con métodos concretos sobre un lote concreto. Esta página explica qué mide cada método, qué deja fuera y cómo se liga el resultado al número de lote impreso en el vial.

Qué se documenta en cada lote

Especificación de pureza: ≥ 98 % por HPLC en todos los productos (fase reversa, área relativa del pico principal)
Identidad: Espectrometría de masas (ESI-MS)
Documentación: COA por lote, con fecha y método de análisis; indica la forma de sal o el contraión
Trazabilidad: Número de lote impreso en la etiqueta del vial y en la caja exterior

Es el mismo estándar que describe la página de calidad y COA. Lo que sigue explica los dos métodos que lo sostienen y los límites de cada uno.

Pureza por RP-HPLC: qué mide

La cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) separa los componentes de una muestra según su hidrofobicidad. La muestra pasa por una columna con fase estacionaria apolar —en péptidos, lo habitual es sílice con cadenas C18— mientras un gradiente aumenta la proporción de disolvente orgánico, normalmente acetonitrilo en agua con un ácido como modificador. Cada especie sale a un tiempo de retención característico y un detector ultravioleta registra un pico.

En péptidos la detección se hace casi siempre entre 210 y 220 nm, la zona donde absorbe el enlace peptídico, de modo que cualquier cadena de aminoácidos da señal. A 280 nm solo responden los residuos aromáticos (triptófano y tirosina): un mismo lote puede dar porcentajes distintos a una y otra longitud de onda, y por eso el método forma parte del resultado.

El porcentaje de pureza es un cociente: el área del pico principal dividida entre el área total de los picos integrados, por cien. Responde a una pregunta concreta: de todo lo que el detector vio en esas condiciones, qué fracción de la señal corresponde a la especie mayoritaria.

Qué no mide el porcentaje de HPLC

No mide contenido absoluto. Un 99 % de área no significa que el 99 % de la masa del vial sea péptido: el agua residual, el contraión (acetato o trifluoroacetato) y las sales inorgánicas no absorben a la longitud de onda de detección o salen con el frente del disolvente, así que no entran en el cociente.
No identifica. El tiempo de retención depende de la columna, del gradiente y de la temperatura; un pico limpio dice que la muestra es homogénea, no qué molécula es.
No ve lo que coeluye. Una impureza muy parecida al péptido —una secuencia con un aminoácido de menos, una forma desamidada, un diastereómero— puede quedar bajo el pico principal si el gradiente no la resuelve.
Depende de la integración. El umbral de área mínima y el trazado de la línea base deciden qué picos pequeños cuentan; dos integraciones del mismo cromatograma pueden diferir en décimas de punto.

Desarrollo completo en qué mide un 99 % por HPLC.

Identidad por ESI-MS: masa observada frente a masa teórica

La espectrometría de masas con ionización por electrospray (ESI-MS) convierte las moléculas de la muestra en iones en fase gaseosa y mide su relación masa/carga (m/z). Un péptido no aparece como una sola señal: capta varios protones y produce una serie de estados de carga, [M+2H]²⁺, [M+3H]³⁺, [M+4H]⁴⁺ y así sucesivamente, cada uno a m/z = (M + n × 1.00728) / n, donde n es el número de protones.

A partir de esa serie se calcula —por deconvolución— la masa M de la molécula neutra, que es la masa observada del certificado. La masa teórica sale de la secuencia declarada, incluidas sus modificaciones (amidación C-terminal, acetilación, cadenas lipídicas, puentes disulfuro). Ambas cifras deben ser del mismo tipo: masa monoisotópica o masa promedio, que en péptidos grandes difieren en más de una unidad.

La identidad se da por confirmada cuando la diferencia entre masa observada y masa teórica cae dentro de la tolerancia del instrumento. En equipos de resolución unitaria esa tolerancia es del orden de 1 Da para péptidos de unos pocos miles de daltons; en equipos de alta resolución se expresa en partes por millón. Las señales adicionales a +22 Da o +38 Da son aductos de sodio y de potasio de la misma molécula, no impurezas.

Qué no resuelve la masa

No cuantifica: la intensidad de una señal depende de lo bien que ioniza cada especie, no solo de cuánta hay. La masa confirma qué es el componente principal, no qué proporción representa.
No distingue isómeros. Dos secuencias con los mismos aminoácidos en otro orden, o un residuo D en lugar de L, tienen exactamente la misma masa.

Más detalle en espectrometría de masas como ensayo de identidad.

Por qué hacen falta los dos ensayos

Los dos ensayos responden preguntas distintas y ninguno sustituye al otro. El cromatograma dice qué tan homogéneo es lo que el detector alcanza a ver; la espectrometría de masas dice si ese componente mayoritario es la molécula declarada. Un 99 % por HPLC sin masa puede ser un 99 % de otra molécula; una masa correcta sin cromatograma no dice nada de cuántas impurezas la acompañan.

Otros ensayos que un COA puede incluir

Además de pureza e identidad, un COA puede incluir otras determinaciones. No todos los certificados las traen; esta tabla describe qué pregunta responde cada una cuando aparece en el documento.

Ensayo	Método habitual	Qué pregunta responde
Contenido peptídico neto	Análisis de aminoácidos o de nitrógeno elemental	Qué fracción de la masa del sólido es cadena peptídica. Es el dato que permite pasar del peso de llenado a la cantidad real de péptido.
Agua residual	Titulación de Karl Fischer	Cuánta agua conserva el liofilizado. Varía entre lotes y no aparece en el cromatograma.
Contraión	Cromatografía iónica u otro método específico	Qué contraión acompaña al péptido (acetato, trifluoroacetato) y en qué proporción de la masa.
Endotoxinas bacterianas	Ensayo LAL o equivalente, en UE por mg	Si el material lleva lipopolisacárido bacteriano, que en un ensayo celular produce respuesta por sí mismo y confunde el resultado.
Aspecto y solubilidad	Inspección visual	Si el liofilizado tiene el aspecto esperado y se disuelve sin residuo en el disolvente indicado.

La relación entre estos datos y la concentración real de una solución está explicada en peso de llenado frente a contenido peptídico neto.

Cómo se liga un COA a un número de lote

Un resultado analítico solo vale para el material del que salió la muestra. El número de lote es lo que une el documento con el vial: identifica una producción concreta, y el certificado que lleva ese número describe esa producción y ninguna otra.

La comprobación no requiere instrumental: el número de lote del COA debe ser idéntico al impreso en la etiqueta del vial y en la caja exterior, la fecha de análisis debe ser coherente con la de fabricación y el método debe estar declarado. Si el número no coincide, el documento describe otro material.

La guía cómo leer un certificado de análisis recorre el documento campo por campo.

Limitaciones: lo que ningún COA demuestra

Un COA describe una muestra del lote en la fecha del análisis, no lo que ocurre después: transporte, almacenamiento, ciclos de congelación o el estado del material una vez reconstituido.
El resultado depende del método. Dos laboratorios competentes pueden reportar purezas distintas para el mismo lote por usar otra columna, otro gradiente u otra longitud de onda.
Un ensayo que no aparece en el documento es un dato que no existe para ese lote. La ausencia de contenido peptídico neto o de endotoxinas no equivale a un resultado favorable: significa que no se midió o no se reportó.
Ningún ensayo analítico dice nada sobre actividad biológica: caracterizar un material de referencia no es evaluar su efecto.

Qué todavía no publicamos

Esta página describe métodos y límites. Hay tres datos que hoy no publicamos:

La acreditación del laboratorio que emite los certificados: su nombre y su ciudad figuran en la carátula de cada certificado, pero no citamos una acreditación que no hemos verificado. Tampoco los valores cuantitativos de cada documento, que están en revisión con el laboratorio.
La frecuencia de análisis: cada lote de producción, cada recepción o una muestra periódica.
Los criterios de aceptación y rechazo: qué resultado, además de la especificación de pureza de la ficha, impide que un lote se venda.

Lo que sí está en línea es la carátula de cada certificado —laboratorio emisor, número de lote, número de certificado y fechas— en certificados de análisis por lote. El panel de determinaciones de cada documento se abre con un número de pedido, y el lote de un vial se localiza en la consulta de lotes. Si tu lote no aparece, el certificado se solicita por correo:

Cómo solicitar el COA de un lote

El número de lote aparece impreso en la etiqueta del vial y en la caja exterior. Cada lote tiene un certificado propio: los resultados no se transfieren entre lotes.

Para solicitar el COA de un lote escribe a contacto@glpmexico.com.mx e incluye:

El nombre del compuesto y la presentación (por ejemplo, la masa declarada del vial).
El número de lote, tal como aparece impreso en la etiqueta del vial o en la caja exterior.
Si ya compraste, el número de pedido, para ubicar el envío.

Lecturas relacionadas

Los términos técnicos están definidos en el glosario.